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    关于纳米抗体你知道多少?


    关于抗体

    抗体(antibody)是指机体由于抗原的刺激而产生的具有保护作用的蛋白质。它是一种由四条多肽链链接组成的Y型蛋白。

    其中两条相对分子质量更大的链为重链,另外两条链则为轻链。每条链有一端为C端,一端为N端,分析抗体四条练链的序列可以发现,在靠近N端的约110个氨基酸序列会存在明显变化,称为可变区,而其他位置的序列则会表现出相对恒定,称为恒定区。

    可变区为抗体结合抗原的位置,重链和轻链的可变区含有3个氨基酸组成高度可变的区域称为互补决定区即CDR1、CDR2、CDR3,其中CDR3有着最高的变化程度。

     

    关于VHH

    然而,并不是所有的抗体都是上述结构,1993年一种只含有重链可变区的重链抗体在骆驼类动物中被发现。文章在NATURE上得到发表。在此之后,在鲨鱼中也发现了重链抗体的存在,但目前,骆驼科动物是进行VHH抗体研究的主要物种。

    纳米抗体即重链单域抗体VHH(variable domain of heavy chain antibody)这类抗体缺少轻链,同时重链恒定区缺少CH1区。其中重链抗体的重链可变区VHH结构可以被单独克隆表达,并表达出与重链抗体相当的抗原结合活性。由于VHH的晶体宽度仅有2.5nm,长4.8nm,分子量约为15kDa,是目前已知的可以结合抗原的最小单位,因此也被称为纳米抗体。

     

    VHH抗体的研究意义

    免疫原性与抗体的分子量呈正相关,因此由于纳米抗体的分子量小,其免疫原性更低,有着更强的组织穿透力,可以穿透血脑屏障,也可以进入类似肿瘤等质密的组织。

    纳米抗体的可溶性强,结构简单,适用于原核(如:大肠杆菌)及真核(如:酵母菌)表达。

     

    VHH文库构建

    动物源性纳米抗体文库

    目前大多数纳米抗体来源于骆驼科动物,但是利用骆驼科动物免疫得到动物源性纳米抗体的过程使漫长且昂贵的,需要大量纯化的蛋白质,并需要大型畜牧业和兽医设施。而且由于自身抗原的免疫耐受性,动物源性抗体往往不能结合保守区,而保守区往往驱动关键的蛋白质功能。

     

    人工合成纳米抗体文库

    由于利用骆驼科动物得到纳米抗体的复杂过程,为纳米抗体研究带来了诸多不便。因此,开发了一种人工合成的纳米抗体库,并构建酵母文库。以骆驼科抗体基因为基础,依据纳米抗体特点,在互补决定区设计变体。对于CDR中特定位置的变化,针对高度可变的位置引入随机化序列,反应这些位置的高度多样性。其中,在CDR1中引入了4个、CDR2中引入了1个、CDR3中引入了7个、11个、15个连续位置的高度多样化序列,这对应着自然条件下纳米抗体CDR3有着最高的变化程度。

    经过评估在通过人工合成的纳米抗体与动物免疫获得的纳米抗体相当,经酵母表面展示及高通量测序,该文库包含了超过108个全长纳米克隆,并能在酵母表面表达和展示。

     

    VHH抗体筛选

    目前,较为常用于VHH抗体展示筛选的主要有噬菌体和酵母。其中,相比于噬菌体表达系统,酵母作为真核表达系统,可以进行翻译后修饰来表达和折叠复杂的真核蛋白。因此可以改变噬菌体展示技术难以进行构象选择性纳米抗体的鉴定的问题。

     

    噬菌体展示

    噬菌体展示技术利用噬菌体载体,将蛋白质的编码基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置,使外源蛋白与特定的噬菌体衣壳蛋白融合表达,展示在噬菌体表面。

     

    酵母展示

    用抗体序列可变区与凝集素Aga2p融合表达,Aga2p蛋白亚基通过两个二硫键与固定在酵母细胞壁上的Aga1p 蛋白亚基结合结合流式分选技术,将靶向抗原的特异性抗体给筛选出来。

     

    酵母双杂筛选

    抗原基因通过与GAL4 DNA结合域(DNA-BD/诱饵)融合在体内表达,VHH克隆到DNA-AD/猎物质粒中,经过Y2H筛选得到对抗原具有特异性的VHH抗体。

    有研究利用酵母双杂筛选VHH,筛选出7种靶向血凝素神经氨酸酶(HN)蛋白的VHHs。血凝抑制试验(HI)显示,7种VHHs可抑制NDV的血凝素活性(HA)。

    实验流程及交付结果

    文库构建

    南京新葡3522新地址生物利用纳米抗体骨架序列IGHV1S1-IGHV1S1S5,通过对PDB数据库中纳米抗体序列进行比对。设计了如下VHH合成序列,对CDR1-3个区进行点随机突变组合,有保守位点,有多样性为2,4或者18的随机位点,其中CDR3区又设计了长度的多态性,有三种长度,分别为12,16,20个氨基酸。将VHH合成基因序列克隆到DNA-AD猎物质粒中,转化到酵母菌中,构成含有108个全长纳米克隆的酵母文库。

     

    文库筛选

    通过将抗原基因与GAL4 DNA结合域(DNA-BD/诱饵)融合在体内表达,与拥有的VHH酵母猎物文库,经过Y2H筛选得到对抗原具有特异性的VHH抗体。

     

    通过自激活验证pGBKT7-C04无自激活活性

     

    将用含有 pGBKT7-C04 诱饵质粒的 AH109 酵母菌株作为受体制备感受态,将文库质粒pGADT7-VHH 转入其中,涂SD-TLH筛选平板。两次筛选共挑取192个克隆。

    192 个阳性酵母克隆,全部PCR扩增,测序后,经过Seqman、BLAST比对,最终获得26 个基因序列。将26个基因序列进行回转验证,结果显示,26个阳性克隆能在SD-TL缺陷型平板上正常生长,26 个阳性克隆能在SD-TLH缺陷型平板上生长,26个阳性克隆能在SD-TLHA、SDTLHA+X-α-gal 平板上生长,23个克隆能在SD-TLHA+X-α-gal缺陷平板上显蓝色。

    交付筛选结果序列

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